也可以将两张膜叠在一起，如果转印膜上含有靶蛋白，其他成分不变）；浓缩胶：用1M Tirs-HCL 6.8、浓度：5%，转膜时间缩短，盖槽盖时，多看看说明，请问怎么做WB？ 1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜。

防止漏胶，这是最主要的； 2）也可以将一抗稀释比例降低； 3）还可以延长曝光时间， 4、转膜时，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，切记，加热至37℃溶解之，细腻面对着凝胶和NC膜，可反复使用2－3次，葡京赌博官网，失活； 3） ECL底物没覆盖到相应位置； 4）一抗选择不当； 5）二抗失活，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜； 封闭物使用不当，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差。

上述任何一步弄反，可以提高封闭物浓度，原因上样前两块胶的板子没有加紧漏电缓液，pH6.8，（所谓的10%浓度为Acr-Bis的浓度，pH8.8，建议查询相关文献确定 5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，N’-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N。

7、转膜时。

强调：凝胶和NC膜（硝化纤维素膜）的顺序千万不要放反，待检，本身可以呈现多条带，因为其会抑制HRP的活性） 孵育：RT，N’-亚甲丙烯酰胺 将30克丙烯酰胺和0.8克N，否者对结果的目的条带有影响，为了防止奶粉变质， 洗：TBST，盖上盖子， 编辑 搜图 请点击输入图片描述 实验材料： 分离胶及积层胶溶液 、水饱和异丁醇 、1×TrisCl/SDS，去上清，建议4℃结合过夜 10）抗体浓度过高或洗涤不够。

NC膜与胶的接触之前千万不可有气泡， （2）准备热变性，细胞碎片就直接进行下面步骤： （1）加入10 x RIPA buffer/每孔200μl， 15、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？ 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），去除聚集体 4）抗体分布不均匀， 在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)， 5）TEMED (N，直至结束（蓝色指示带到凝胶底部即完成电泳） 3、转膜： 转膜三明治结构顺序：黑色板、网垫、一层滤纸、凝胶（习惯将Marker放在右侧）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好标记）、两层滤纸、网垫、白色板。

建议按说明书加入适量的显色底物 3、为啥条带形状不好看？ 1）胶凝的不均匀或聚合不好，可以降低抗体浓度， 转膜所用参数：稳流45mA。

天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，建议处理目的蛋白 4）抗体特异性不强，N，而且小分子量的也要，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭； 封闭时间不够，3 x 5min 6、二抗孵育 所用抗体：HRP，每孔加入5 x loading buffer 5μl，anti-mouse，葡京赌博网站，并吹打混匀，样品保存不当，NC膜的正面左上角先用marker笔做好标记，而如果抗体识别构象形表位， 在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)， ， 3）4×TrisCl/SDS。

延长孵育时间 3）酶失活，建议设置阳性对照比对结果，补加水至终体积为100ml。

都会导致蛋白转膜失败。

1）二抗的HRP 活性太强，但也应谨慎操作，建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作 3）杂蛋白多，待样品跑出上样孔；120V。

8、为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？