知识分享：稳转株的制备

实验原理：

利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少，葡京赌博官网，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。相对于此，稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株，稳转株生产蛋白稳定性更好，批次差异性更小。

稳定转染的应用

稳定转染适用原因

 

稳定转染应用

 

外源基因要整合到细胞染色体上

 

基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究

 

细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞 基因组存在差异，会对实验结果造成干扰

 

单克隆稳转株筛选

 

外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源 基因片段很快丢失

 

需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞

 

一些蛋白稳定性很强，瞬时 RNA 干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白

 

需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果

 

稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的 成本，也很大程度上方便实验研究

 

在某些细胞中长期研究基因的功能

 

通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导 效率的细胞高效表达外源片段

 

获得外源片段的高效表达

 

避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选 有助于筛选出拷贝数适量的细胞

 

得到过表达的目的基因或干扰拷贝数

 

影响稳定转染的因素

1、外源基因整合的几率

决定了稳转株筛选的简易程度，有利于稳定转染细胞的获得；

2、插入外源基因片段的拷贝数

一般情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；

3、整合位点转录活跃度

整合位点转录活跃度决定了稳转株筛选细胞后稳转株中外源基因片段的表达质量；

4、外源基因片段整合到细胞后的稳定性

不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。

制备稳转株的实验步骤

一．准备及预实验

1、确定细胞系相关信息：需包括如下内容

细胞系名称

 

细胞培养条件

 

细胞增殖速度

 

支原体污染情况

 

注：务必保证细胞无支原体污染，方可进行稳转株构建！

2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值

3、预实验确定筛选药物用量：

（1）查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息；参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）；

（2）D0将细胞铺于6孔板中，使D1细胞融合度约90%；D1按（1）中设置的药物梯度，加入药物；

（3）D4换液，并重新加入药物；

（4）D7观察，找到致死率100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。

二．稳转株筛选及构建

注：以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！

1、细胞铺板：D0将细胞接种于6孔板中（4个孔），使D1细胞融合度约70%

病毒感染：