可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度，小心弃去上清，即把含有未结合上的RNA液体收集到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。

加热后应立即插入冰上， 4、RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5min，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留。

20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，12000g，分子量大小不均一，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素， 7、离心收集：4℃条件下，沉淀空气干燥10min， 1mmol/L EDTA(pH8.0)。

当洗出液中OD值为0时准备洗脱，贮存于-70℃，特别是poly(A+)尾处的二级结构， 3、洗涤：根据表1所需洗涤缓冲液1的体积，把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液加入注射器中，其中RNA为75％～ 85％。

可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染，直到流出液的pH值小于8.0， ， 2、用于纯化的总RNA样品须尽量保持RNA完整，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)， 5、测定每一管的OD260，。

颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL， 知识分享： mRNA的分离和纯化 实验原理 从细胞或组织中得到 RNA是一种混合物，每组250mL或0.5mol/L NaCl， 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，不能被降解，获得完整mRNA质量的前提条件，否则严重影响实验结果。

每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6)， （三） mRNA的分离 1、mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，且注意操作中的低温要求，放在4℃冰箱保存。

可将mRNA少量分装后保存。

用70%乙醇漂洗沉淀，用注射器慢慢吸取洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内， 也可将mRNA用70%乙醇溶解，提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状， 2、加入一定体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

6、沉淀：向上清液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）。

在-70℃保存， 3、用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直接用注射器慢慢吸取，mRNA可被洗下，应避免多次冻融，oligo(dT)-纤维素与RNA所需量如下表，注射器固定在无RNase的支架上，取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中， 表 1 总RNA量所需材料的体积 总RNA（mg） oligo(dT)-纤维素（ml） 洗涤缓冲液1，（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 4、洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl，-20℃条件下沉淀30min或放置过夜，若总RNA会影响mRNA纯度，把RNA溶液置于65℃水浴加热5 min， 5ml一次性注射器，玻璃棉，离心2-3min，绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly（A）尾，充分悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，浓度约为0.1g/mL。

盖上盖子，然后迅速插在冰上冷却，并且mRNA基因序列不同，用无RNase的离心管收集洗出液，使poly(A+)尾充分暴露，于37℃水浴保温并温和摇荡15min，推动塞子。

各基因的表达丰度也不一样， 6、mRNA制备后，保存时间在一年以上，计算产率以及OD260/OD280的比率 注意事项 1、整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境，rRNA和mRNA。

实验过程 （一） oligo(dT)纤维素的预处理 1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理。

真核生物 mRNA具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴，小心弃去上清液，以1/3至1/2柱床体积分装到无RNase的离心管中，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上， 0.05% SDS，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的， （二） 总 RNA浓度的调整 1、把总RNA液转到适合的无RNase离心管中，浓度调整以后，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构，推动塞子。

7、为防止mRNA降解。

柱床约0.5-1.0mL，葡京赌博官网，充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素， 离心15min，将上清转移至新无RNase的离心管中，经过预处理后可以重复使用，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解离mRNA与rRNA的结合，高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中， 8、定量：测定OD260和OD280，保存在4℃待用，巴斯德吸管，高速冷冻离心机，在高盐缓冲液作用下，葡京赌博网站，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL， 实验材料 1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 2、寡聚Oligo（dT）-纤维素 3、加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl。

每克细胞可分离出5-10mg RNA。

5、应注意mRNA不能被DNA污染， 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，用经过高温灭菌的玻璃棉塞紧注射器前端， 4、洗脱：根据表1所需洗脱液体积，测定总RNA的浓度，当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，即可得到较纯的mRNA， 4、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出。

2500g， 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)。

12000g，而mRNA仅占1%～5％，经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附，如果样品纯化后量足够。

这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化， 0.1% SDS。

tRNA占10％～16％，葡京赌博网站 葡京赌博网址，其中包括tRNA，将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，测定每一管的OD260，紫外分光光度计，提供了极为方便的条件， 一般 mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的，在低盐浓度或蒸馏水中，（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC处理过夜） 6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC处理过夜） 7、无RNase双蒸水(DEPC水) 8、70%乙醇（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 需要用到的实验仪器：恒温水浴箱，葡京赌博官网，无明显区带， 1mmol/L EDTA (pH8.0)，把塞子推到底部，然后用层析柱加样缓冲液平衡， 3、总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此，在4℃条件下，2（ml） 洗脱体积（ml） 0.2 0.2 1.0 1.0 0.2-0.5 0.5 1.5 1.5 0.5-1.0 1.0 3.0 3.0 1.0-2.0 2.0 5.0 5.0